Обработка ферментами

После обработки ферментами ткани отмывают в 20 мл Среды 7, фильтруют через нейлоновое сито с диаметром ячей 500 мкм, чтобы отделить более крупные куски, и через нейлоновое сито с диаметром ячей 200 мкм, чтобы отделить сосудистые тяжи. Фильтрат центрифугируют 5 мин при 100 G. Осадок промывают еще два раза Средой 7, причем перед вторым промыванием смесь переносят в стеклянные пробирки на 15—20 мл. После последнего центрифугирования в течение 5 мин при 100 G аккуратно удаляют надосадочную жидкость, быстро перевернув пробирки, и осторожно ресуспендируют осадок в нескольких каплях Среды 3. Добавляют еще 5 мл Среды 3 и сверху осторожно наслаивают 2 мл Среды 2 , а затем 1 мл Среды 1. После центрифугирования в течение 5 мин при 250G из слоя раздела фаз пастеровской пипеткой отбирают чистую фракцию протопластов. Осадок обычно состоит из хлоропластов и разрушенных клеток, но перед выбрасыванием его стоит проверить под световым микроскопом на наличие протопластов. Если в осадке обнаружено много протопластов, к сахарозной среде можно добавить 5 — 10% декстрана Т20 и повторить выделение.

Определение скорости выделения кислорода хлоропластами полярографическим методом в присутствии экзогенных акцепторов Электронов и разобщителей. Для проведения теста производят сравнительный анализ активности хлоропластов исходной суспензии и хлоропластов, подвергнутых осмотическому шоку. Анализ ведут в присутствии 3 мМ феррицианида калия и при добавлении NH4C1 .